2月12日，中国科学院北京基因组研究所（国家生物信息中心）副研究员康禹及其团医院风湿免疫科栗占国研究团队合作，发现类风湿患者肠道中丁酸代谢菌群通过影响肠道内丁酸净含量，参与类风湿关节炎疾病活动、抗体生产和关节变形，揭示了肠道内丁酸代谢菌在类风湿关节炎发病机制中的关键作用，以及丁酸调节类风湿关节炎患者免疫反应的分子机制，提示了丁酸对类风湿关节炎临床治疗潜力。相关研究成果以Intestinalbutyrate-metabolizingspeciescontributetoautoantibodyproductionandboneerosioninrheumatoidarthritis为题，在线发表在ScienceAdvances上。
该研究中，针对人类肠道菌群的高度多样性和宿主异质性造成的特征菌群检出效力不足的问题，研究人员采用了新的宏基因组分析策略——“类配对”算法。该策略原理上类似于双生子研究识别疾病相关遗传变异。在高维度的宏基因组数据中，组成成分高度相似但分属不同组别（case-control）的样本视为“双生子”，即配对样本，基于新组成的配对样本队列进行宏基因组数据分析，可以更好地控制个体间的高度多样性，增加统计效力，提高识别疾病关联微生物组特征的敏感性和稳定性。研究利用“类配对”算法发现了多种产丁酸菌和耗丁酸菌在类风湿患者与健康人群的肠道组成中呈现相反的分布趋势，并且这些丁酸代谢相关物种丰度与ACPA抗体、类风湿因子等临床指标呈现强关联性。基于这些丁酸代谢菌种的丰度建立的诊断模型，可以准确区分患者和健康人群，预测患者发生关节变形的准确率高达98.6%。为了验证丁酸代谢在类风湿发病和炎症反应中的作用，科研人员进一步开展粪便及血液的代谢组、类风湿关节炎患者的免疫细胞功能以及胶原蛋白诱导的关节炎动物模型研究，从多侧面证实了类风湿关节炎患者的血、粪便丁酸浓度低于健康人，而正常的丁酸浓度可以下调多种促炎因子的表达，诱导Treg细胞分化，抑制Th17和滤泡辅助T细胞（Tfh）以及破骨细胞活性；在类风湿模型小鼠膳食中添加丁酸盐补充剂，可以显著抑制关节炎的发生，促进Tfh和Treg的平衡，减少自身抗体产生。该研究揭示了肠道中丁酸盐代谢物种在类风湿关节炎发病及发展过程中的关键作用，为未来通过饮食或微生物治疗改善类风湿关节炎提供了理论基础。
研医院和北京基因组所（国家生物信息中心）等合作完成。研究工作得到国家重点研发计划、国家自然科学基金等的资助。
论文如下
肠道丁酸盐代谢物种有助于类风湿性关节炎的自身抗体产生和骨侵蚀摘要
类风湿关节炎(RA)肠道微生物群的致病和有益物种与代谢之间的不平衡仍未阐明。在这里，使用基于鸟枪法的宏基因组测序对初治患者队列和“准配对队列”方法，我们观察到RA患者缺乏产生丁酸盐的物种和绝大多数丁酸盐消费者。这些结果主要发生在ACPA阳性的患者中，平均AUC为0.94。该小组还在已建立的RA中得到验证，在关节畸形患者中的AUC为0.。此外，我们发现丁酸盐促进了Tregs，同时抑制了Tconvs和破骨细胞，由于增强了HDAC表达的降低和促炎细胞因子基因的下调。通过重新平衡TFH细胞和Tregs以及减少抗体产生，膳食丁酸盐补充剂在小鼠模型中具有抗炎作用。这些发现揭示了丁酸盐代谢物种的关键作用，并暗示了基于丁酸盐的治疗对RA患者的潜力。
介绍
类风湿性关节炎(RA)是一种自身免疫性疾病，其特征是关节破坏、全身受累和存在自身抗体，尤其是抗瓜氨酸肽抗体(ACPA)。临床上，ACPA的存在表明软骨和骨骼严重受损的可能性增加，以及严重的关节变形导致预后更差。对疾病病理生理学的深入研究表明，各种炎症通路可导致RA出现异常的全身免疫反应。有人提出，失调的免疫反应的起源发生在遗传易感性个体中，环境对环境的贡献很大。在环境因素中，肠道微生物群已成为RA异常全身免疫反应的可能候选者。
肠道微生物组对于维持免疫稳态和扰乱肠道微生物群组成的平衡至关重要，这可以改变局部适应性免疫反应并调节全身炎症。此外，肠道微生物群衍生的代谢物，特别是短链脂肪酸(SCFA)，可以通过调节T细胞的葡萄糖代谢来诱导T细胞的代谢改变。最近的多项证据强调肠道菌群失调与RA的发病机制有关。一项开创性研究报告称，普雷沃氏菌丰度的增加与拟杆菌属的减少和新发未经治疗的RA(NORA)患者中有益微生物的丧失相关。随后的研究表明，RA患者的肠道菌群失调与革兰氏阴性菌的消耗和革兰氏阳性菌的富集有关。
虽然已经在RA中描述了口腔和粪便生态失调，但由于个体间的高度多样性，研究障碍仍然存在，这受到遗传、年龄、饮食和健康状况等广泛因素的影响。个体多样性通常如此之大且难以控制，以至于它甚至压倒了与疾病相关的改变，并深刻影响了与疾病相关的微生物组特征的识别。因此，宏基因组研究的结果高度依赖于收集的样本，并且通常包括随机假阳性或假阴性。
遗传学研究长期以来一直利用双胞胎研究的机会来识别因果遗传特征。这一概念已扩展到“配对”动物研究的宏基因组学研究，其中配对样本是从具有不同表型的共同饲养动物或纵向采样中获得的。在此概念的基础上，我们之前描述了一种新的宏基因组分析策略，即“准配对队列”，其中我们配对显示相似物种谱但不同表型的样本。简而言之，该方法从包含物种丰度的矩阵开始，该矩阵包含从表现出二元表型（例如，患病与健康对照）的样本的基于测序的宏基因组数据推断。该矩阵用于以每个检测到的物种作为维度来填充高维空间。假设两个样本具有相似的物种概况但具有相反的表型，理论上应该位于欧几里得空间中描绘两个表型状态的边界附近，我们引入了“边界样本”的概念——最近邻居具有相反表型的样本，并将每个边界样本与其对面的最近邻居之一配对，形成“双胞胎”。为了避免偏差，我们为两侧选择了多个平行边界样本，然后比较了孪生样本中每个物种的丰度或存在/不存在，以确定两种表型中每一种的候选物种（详见材料和方法）。这种方法使我们能够将原始群组转化为配对群组，这不仅可以控制个体多样性，还可以增加统计功效。
在本研究中，通过使用准配对队列策略，我们报告了RA患者中丁酸盐产生物种的缺乏和丁酸盐消费者的富集，这与ACPA的产生和关节畸形有关。我们进一步表明，膳食丁酸盐补充剂赋予了重新平衡滤泡辅助T(TFH)细胞和调节性T细胞(Tregs)的抗炎益处。我们的研究结果揭示了丁酸盐代谢物种在RA发病机制中的关键作用，并表明丁酸盐在RA中的治疗潜力。
结果丁酸盐代谢物质的组成与RA相关
在比较25名初治RA患者与29名年龄和性别匹配的健康个体时，两组在微生物多样性方面没有表现出显着差异。两组之间所有细菌物种的单变量比较没有发现任何显着偏离的物种[Mann-WhitneyU检验，错误发现率(FDR)0.05]，考虑到宏基因组数据中的大量个体间多样性，这并不奇怪。处理这些高维数据集非常困难，因为众多的辅因子很难控制。控制多样性的一种常见方法是执行通常包含大量样本的荟萃分析。
这些物种中有相当一部分（种中有55种（29.6%）可以代谢丁酸）。值得注意的是，55个与RA相关的丁酸盐代谢者中有51个（92.7%）是丁酸盐消耗者，其中46个在RA患者中富集，而只有5个在对照组中富集，表明RA患者肠道中消耗丁酸盐的微生物组增强。对配对样本之间每个物种的代表性频率（样本中存在或不存在）进行更严格的测试，确定了更严格的57种RA相关物种（Kolmogorov-Smirnov测试，P0.），包括38.6%（57个中的22个）丁酸盐代谢物种。根据该小组，在RA患者中发现了更显着的丁酸盐消费者富集（RA，19种与健康对照，1种）。在RA患者中，该RA相关组中丁酸盐生产者和丁酸盐消费者的总丰度也分别显着降低和显着增加（Mann-WhitneyU检验，P0.05；），这表明丁酸盐代谢明显紊乱在RA。
与RA全身炎症和自身抗体产生相关的核心丁酸盐代谢物质
ACPA的存在与更严重的关节变形和预后不良有关。因此，我们询问丁酸盐代谢物种是否与自身抗体产生相关。使用准配对队列方法比较来自NORA队列的25名初治ACPA阳性RA患者与15名初治ACPA阴性RA患者，我们确定了92个ACPA相关物种（Wilcoxon配对样本的符号秩检验，P0.）；92人中有37人（40.2%）是丁酸盐代谢者。其中，64.9%（37名中的24名）丁酸盐消费者和仅2.7%（37名中的1名）丁酸盐生产者富含ACPA（+）组，而32.4%（37名中的12名）丁酸盐生产者富含ACPA（-）没有富集丁酸盐消费者的组。丁酸盐代谢物种的比例（92个中的37个，40%）远高于它们在肠道宏基因组中的通常比例。此外，小组中与ACPA相关的丁酸盐生产者和消费者显示出与临床特征截然相反的相关性（Spearman相关性；）。这些丁酸盐生产者和消费者的总丰度在ACPA(-)和ACPA(+)患者之间也表现出显着差异（P0.）。因此，基于上述观察结果和其他研究评估的丁酸盐的抗炎作用，我们将ACPA相关物种小组中的12名丁酸盐生产者和24名丁酸盐消费者定义为RA相关物种的核心小组。
我们进一步研究了核心组与RA临床标志物的相关性。核心物种中丁酸盐生产者与丁酸盐消费者的比例与RA的各种临床表现和自身抗体滴度呈显着负相关。然后，我们构建了一个随机森林分类器，以面板中36个物种的丰度作为输入，在区分ACPA(-)患者和ACPA(+)患者方面表现出优异的性能，平均线下面积(AUC)为0.94在接受者操作特征（ROC）曲线评估中。当与降低的基尼分数（表示每个物种对模型的贡献）进行排名时，排名靠前的物种包括丁酸盐生产者和丁酸盐消费者，表明它们都与确定ACPA状态有关。
核心丁酸盐代谢物种表明RA中的骨侵蚀和关节畸形
为了验证丁酸盐代谢核心组对RA的影响，我们招募了另一组37名已确诊的RA患者和匹配良好的健康个体（n=31；），尤其是那些有关节侵蚀的人。与对照相比，已建立的RA患者中丁酸盐生产者与消费者的比例显着降低，这通过与目标代谢分析中的对照相比，RA患者的血清和粪便丁酸盐水平显着降低得到证实所有受试者的SCFAs（Mann-WhitneyU检验，P0.05；)。接下来，我们将已建立的患者分为DJ（变形关节；n=13）和NDJ（无变形关节；诊断后2年，n=20）组，并比较了他们的ACPA相关丁酸盐生产者或消费者物种的总丰度。DJ患者的生产者/消费者比率显着降低，与靶向测量中血清和粪便丁酸盐浓度显着升高一致（Mann-WhitneyU检验，P0.05；）。
丁酸盐的产生影响RA的炎症状态
在验证队列中，ACPA相关小组中的丁酸盐生产者和丁酸盐消费者也表现出与炎症标志物和由疾病持续时间标准化的变形关节数量的反向相关性（Spearman相关性）。随机森林模型经过训练以区分NORA队列中的ACPA状态与ACPA相关组中36种丁酸盐代谢物种的丰度，由验证队列测试以预测已建立的RA患者的结果，即他们是否发展了变形的关节。当使用ROC评估时，该模型区分DJ组和NDJ组的准确率为0.，表明ACPA的产生和关节侵蚀都与肠道丁酸盐代谢有关。一致地，粪便和血清丁酸盐浓度的测量显示，疾病活动度低（通过疾病活动度评分，DAS28-ESR2.6评估）的RA患者的丁酸盐水平显着高于疾病活动度高（DAS28-ESR≥2.6）的患者（Mann-WhitneyU检验，P0.），粪便丁酸盐水平与RA患者的变形关节数呈负相关（P0.）。
丁酸盐治疗抑制RA患者的破骨细胞分化
由于DJ患者的丁酸盐生产者/消费者比率显着降低，我们随后检查了丁酸盐是否影响RA中的骨破坏。在这项研究中，人体数据表明，RA患者的粪便和血清丁酸盐水平较低，而Rankl水平升高，Rankl是破骨细胞信号传导的重要组成部分（Mann-WhitneyU检验，P0.05）。在体外，破骨细胞分化试验表明丁酸盐抑制破骨细胞的分化，这与最近的一项研究一致，显示了补充肠道微生物代谢物对骨骼恢复的潜在影响。机械地，丁酸盐给药导致破骨细胞分化和组蛋白脱乙酰酶（HDAC）减少中的KEGG（京都基因和基因组百科全书）途径的变化。总之，这些结果表明丁酸盐改变了RA破骨细胞的分化并防止骨破坏。
丁酸盐直接促进Treg极化并抑制Tconvs和促炎细胞因子
为了进一步探索肠道丁酸代谢对自身抗体产生的影响机制，我们评估了循环CD4+T细胞的亚型[包括Tregs、TFH、Thelper17(TH17)、TH1和TH2]在RA患者中。我们观察到与高水平粪便丁酸盐相关的RA患者中循环Tregs的比例显着增加（Mann-WhitneyU检验，P=0.）。我们还将丁酸盐与来自RA患者的外周血单个核细胞(PBMC)共培养，发现Tregs的百分比增加和TFH和TH17细胞显着减少，但不是TH1和TH2细胞。
此外，为了了解丁酸盐如何支持Treg分化，从RA患者的PBMC中分离出CD4+T细胞并在体外用丁酸盐处理4天，以及Tregs和效应Tconvs（常规TH细胞）之间的调节差异用RNA测序(RNA-seq)评估。Tregs和Tconvs之间改变的基因出乎意料地不同，只有39.4%的基因是共享的。微分表达式显示在火山图中。正如预期的那样，与T相比，丁酸盐给药后的Tregs具有独特的基因表达谱。丁酸盐给药后的regs，Tconv分化和RA发展中相关免疫因子的下调。这些基因是已知的TFH、TH17、TH1、TH2和相关的自身免疫基因，这表明丁酸盐不仅可以促进Tregs还可以抑制Tconvs和炎性细胞因子，可能帮助导致免疫系统的止血。具体而言，某些HDAC亚型在Tregs中减少由于丁酸盐的给药。总之，这些数据表明丁酸盐选择性地促进了Tregs并抑制了Tconvs，这表明对RA的免疫平衡有重大影响。
丁酸盐通过调节细胞和体液免疫反应抑制CIA小鼠的关节炎
接下来，我们使用胶原蛋白诱导的关节炎(CIA)模型来研究体内丁酸盐是否可以对RA产生保护作用。在胶原蛋白免疫的第一天开始富含丁酸盐的饮食。与以正常食物喂养的对照CIA小鼠相比，丁酸盐补充剂显着增加了粪便和血液中的丁酸盐水平（P0.05），伴随着关节炎的总体发病率显着降低（11%对85%，P0.01），减轻关节炎症的严重程度（P0.05），以及以缺乏骨破坏为特征的轻度关节炎。
与对照CIA小鼠相比，添加丁酸盐的小鼠血清白细胞介素10(IL-10)水平显着升高（.9±6.pg/ml对比53.1±12.71pg/ml，P0.01），血清水平显着降低IL-6（41.88±11.74pg/mlvs91.14±18.75pg/ml，P0.01）和自身抗体（1.±0.×U/mlvs2.±0.3×U/ml，P0.01）。T细胞的流式细胞术分析显示，补充丁酸盐显着增加了CD4+CD25+Foxp3+Tregs的比例在两个联合引流淋巴结(DLN)(P0.01)和派尔斑块(P0.01)中，CD4+CD44+CXCR5+PD-1+Bcl6+TFH细胞的比例降低在两个联合引流淋巴结（P0.01）和派尔斑（P0.01）中，与之前关于丁酸盐对T细胞亚群调节的影响的报道一致。卵泡调节性T(TFR)细胞已知会抑制TFH细胞分化和生发中心形成。在CIA小鼠中补充丁酸盐也显着增加了CD4+CD44+CXCR5+PD-1+Foxp3+TFR细胞的数量，尤其是在DLN中。此外，我们还发现B+CD4-CD95+GL-7+生发中心B(GCB)细胞的比例显着降低(P0.)。这些结果证实了肠道丁酸盐在RA发展中的保护作用。
讨论
我们的研究提供的证据表明，调整后的肠道微生物群增加丁酸盐产生物种和减少丁酸盐消耗可以增加丁酸盐产量，并与轻度炎症状况和良好预后相关。
在这里，通过应用超敏感分析方法——准配对队列，我们证实了丁酸盐代谢物种在临床RA队列中的重要作用，并揭示了肠道丁酸盐消费者对最终丁酸盐浓度的贡献，这突出了双方的影响丁酸盐代谢（生产者和消费者）对Tregs和效应Tconvs的失调（或失调）的影响。我们还建立了一组物种，专门区分ACPA阳性和关节变形的患者。尽管许多研究已经确定了丁酸盐如何影响肠上皮细胞和免疫系统的分子机制，这可能对RA或其他自身免疫性疾病有益,仍然迫切需要证据证明其在临床研究中的保护作用和过程的描述。
以前的研究报道，RA患者的粪便丁酸盐显着减少。人肠道中丁酸盐生产者和丁酸盐消费者之间的相互作用保持动态平衡。丁酸盐消费物种，例如假单胞菌属，即使没有碳水化合物供应，通常也很健壮，能够在恶劣的环境中生存。这些物种可以生活在各种碳源上，例如丁酸盐、乳酸、醋酸盐等。丁酸盐是高热量的最佳营养素之一，但它不是它们生存所必需的。肠道丁酸盐主要由产丁酸物种提供，但如果供应不足，丁酸盐消费者可以使用其他营养物质来生存。
我们的研究结果表明，在DJC和ACPA(+)发生率较低的RA患者中产生丁酸盐的细菌丰度明显增加，表明丁酸盐在减轻炎症中的潜在作用。我们发现，由生产者和消费者之间的比率推断并得到代谢物测量支持的丁酸盐净产量与疾病活动、抗体产生和关节畸形呈负相关，这进一步巩固了丁酸盐在RA中的保护作用。
丁酸盐对抑制CIA至关重要，可能通过Treg/IL-10/TH17轴或通过B细胞调节。我们的研究表明，较高的丁酸盐与RA患者的Tregs增加有关。我们发现的另一个方面是，单独的丁酸盐饮食可以保护CIA小鼠免受关节炎的侵害，同时促进Peyer斑和关节引流淋巴结中的Tregs和抑制TFH细胞。在这方面，我们和其他人报告说，血液中循环TFH细胞的存在表明自身免疫状况和疾病激活，包括RA和系统性红斑狼疮(SLE)。我们在这里要强调的是，除了丁酸盐对Tregs有很强的促进作用外，对效应Tconvs的影响，例如TFH细胞，是相当具体的。TFH的主要功能细胞是激活GCB细胞以分化为血浆和记忆B细胞，导致自身免疫性疾病中自身抗体的产生，例如RA患者中的ACPA。因此，我们最终确定，通过影响T细胞分化为止血，肠道丁酸盐暴露可能会恢复免疫平衡并抑制局部的自身免疫，例如肠道或关节炎等远端组织目标。所有这些事实表明，丁酸盐可以消除RA患者的炎症并暗示未来的治疗应用。同时，丁酸盐抑制破骨细胞分化，加重了类风湿关节炎的关节畸形。因此，我们的数据证明了丁酸盐在防止关节畸形方面的多重功效，这与之前的研究结果一致。
然而，ACPA相关的丁酸盐代谢物种的相对丰度非常低。丁酸盐生产者的丰度从其主要栖息地回盲部沿结肠逐渐减少。当我们在本研究中使用粪便样本时，我们检测到的丁酸盐生产者只是肠道中丰富种群的一部分。然而，组间粪便丁酸盐产生者的差异可能表明上结肠存在差异，这些物种在微生物菌群中占相当大的比例，并以生理相关的方式导致血清和粪便丁酸盐的变化。不幸的是，目前的宏基因组研究无法确定每个个体中丁酸盐代谢细菌的绝对数量，因为在常规宏基因组研究中没有添加内部参考，
总之，对RA患者的宏基因组和代谢分析确定了一个常见的丁酸盐代谢物种小组，该小组与ACPA状态和关节畸形的结果在机械上相关，这支持了微生物来源的肠道丁酸盐在RA全身免疫调节中的保护作用。这些发现也为未来关于通过饮食或基于微生物组的治疗改善RA患者的肠道丁酸代谢的临床研究提供了强有力的理论依据。
材料和方法研究设计和样本收集
该研究招募了18至70岁的男性和女性RA患者，根据年美国风湿病学会和欧洲抗风湿病联盟(EULAR)分类标准进行诊断。如果个体患有任何其他急性或慢性疾病，则被排除在外。队列I(NORA)包括40名初治RA患者（25名ACPA阳性RA患者和15名ACPA阴性RA患者）和29名年龄和性别匹配的健康个体。队列II（既定RA）包括37名接受标准治疗的既定RA患者和31名年龄和性别匹配的健康对照。该研究按照赫尔辛基宣言和国际协调会议良好临床实践指南的规定进行，并医院伦理委员会的批准。试验方案和所有相关研究表格医院机构审查委员会批准（批准文号：PHB）。所有患者都提供了书面知情同意书。
宏基因组测序和注释
所有粪便样本医院采集，冷冻运送至中科院北京基因组研究所，-80℃保存用于后续宏基因组测序。我们使用EZNASoilDNAKit(D-02,OMEGA)从粪便样本中提取DNA，并在IlluminaHiseq0/平台上进行双端宏基因组测序[碱基对(bp)/bp×2;插入大小，bp]。接下来将原始读数应用于质量控制，其中模糊序列和接头通过FastQC（版本0.11.5）过滤，低质量碱基和读数通过Trimmomatic（版本0.33，选项：SLIDINGWINDOW:4:20MINLEN:40）或FASTX-Toolkit(
